LF200倒置熒光顯微鏡

CCK-8細胞活力檢測實戰全攻略

操作技巧 · 問題排查 · 圖像分析 · 高級拓展

圖1  國產萊特LF200倒置熒光顯微鏡——你的CCK-8檢測好搭檔

寫在前面：為什么你的CCK-8實驗需要一臺顯微鏡？

做過CCK-8的同學都有過這樣的經歷：酶標儀讀數出來了，OD值忽高忽低，復孔之間差得離譜，IC??算出來跟文獻差了十萬八千里。你反復檢查加樣步驟、孵育時間、酶標儀設置，卻忽略了一個最關鍵的問題——你根本沒看過細胞長什么樣！

CCK-8的OD值只是一個「黑箱數字」，它告訴你孔里有多少代謝活性，但不會告訴你：細胞是貼壁的還是漂了？是正常形態還是皺縮凋亡了？是均勻分布還是聚成一團？有沒有污染？有沒有氣泡？這些問題，只有顯微鏡能給你答案。

本文將以國產萊特LF200倒置熒光顯微鏡為例，從實驗前準備到最終圖像分析，手把手教你如何把顯微鏡融入CCK-8檢測全流程，讓你的實驗數據更可靠、更有說服力。文章中穿插了大量實操技巧和常見問題排查方案，建議收藏備用。

第一部分  實驗前準備：磨刀不誤砍柴工

1.1  設備檢查清單

在開始實驗前，請務必檢查LF200顯微鏡的以下部件，確保設備處于最佳工作狀態：

·       光源系統：透射LED明場光源是否正常點亮？亮度調節是否順暢？電動熒光激發盒顯示屏是否正常顯示通道信息？

·       物鏡系統：物鏡轉盤切換是否順暢？各倍率物鏡鏡頭是否清潔、無霉斑無油污？建議用擦鏡紙蘸少量無水乙醇混合液（7:3）輕輕擦拭。

·       相差裝置：相差轉盤各檔位（0、4×、10×、20×、40×）是否清晰可辨？旋轉是否有明確的卡位感？

·       載物臺與托板：載物臺移動尺是否順滑？96孔板專用矩形托板和培養皿用圓形托板是否齊全？

·       成像系統：C-MOUNT接口相機是否連接正常？成像軟件是否能正常預覽和采集？建議提前測試一次拍照功能。

·       調焦系統：粗調/微調手輪是否操作順暢？限位裝置是否設置合理（防止物鏡上移時碰撞樣本）？

圖2  LF200載物臺及培養容器托板——左為矩形托板（適配96孔板），右為圓形托板（適配培養皿）

1.2  細胞準備的三個關鍵控制點

CCK-8實驗的重復性，80%取決于細胞準備階段。以下三個控制點請務必注意：

控制點一：細胞狀態。務必使用對數生長期的細胞，避免使用傳代次數過多（>30代）或剛復蘇的細胞。細胞狀態差時，即使對照組的OD值也會偏低且不穩定。建議在實驗前一天換液，確保細胞處于最佳代謝狀態。

控制點二：接種密度。接種密度是CCK-8實驗最關鍵的參數之一。密度過高，細胞在培養過程中過度融合，OD值進入平臺期，藥物抑制效應被掩蓋；密度過低，OD值太低，信噪比差。建議根據細胞大小和增殖速度預實驗摸索最佳接種密度。對于HepG2等中等大小的腫瘤細胞，96孔板推薦接種密度為3000-8000個/孔，培養24-48 h后匯合度達到60%-70%為宜。

控制點三：接種均勻性。96孔板接種時最常見的問題是細胞分布不均勻——邊緣孔細胞少、中間孔細胞多，或者細胞全部聚集在孔的中央。解決方法：消化細胞時充分吹打制成單細胞懸液；接種時邊加邊輕輕晃動培養板（十字形晃動，不要畫圈）；接種后在室溫下靜置15-20 min再放入培養箱，讓細胞自然沉降均勻分布。

圖3  LF200下培養皿原位觀察——無需開蓋，直接觀察細胞貼壁狀態

第二部分  全流程操作詳解：每一步都有技巧

2.1  第一步：給藥前細胞狀態檢查（別跳過！）

很多同學接種后直接給藥，從不檢查細胞狀態，這是導致實驗失敗的常見原因。正確的做法是：給藥前用LF200顯微鏡快速檢查各孔細胞狀態。

操作方法：將96孔板放在LF200載物臺上，用10×明場或相差物鏡快速掃一遍各孔。重點關注：

·       細胞匯合度是否一致？如果某孔細胞明顯偏少或偏多，標記出來，后續數據分析時考慮是否剔除。

·       細胞是否均勻分布？如果細胞聚集在孔中央或邊緣，說明接種不均勻，這孔的數據可靠性存疑。

·       有無污染跡象？如果發現孔內有游走的小黑點、菌絲或培養基渾濁，立即標記并隔離，避免污染擴散。

·       有無氣泡？接種時產生的氣泡會影響細胞貼壁和后續OD讀數，用無菌槍頭小心戳破。

技巧提示：LF200的WF10X/22 mm大視野目鏡比普通目鏡視野大將近一半，掃板效率大大提高。熟練的話，一塊96孔板5分鐘就能全部檢查完。

圖4  大視野目鏡的優勢——Φ22 mm視野比Φ18 mm多觀察近50%的細胞面積

2.2  第二步：給藥與孵育

給藥時注意以下幾點：

·       藥物濃度梯度建議采用3倍或10倍稀釋，覆蓋從無抑制到抑制的全范圍，至少設置5-7個濃度點。

·       給藥時先吸去舊培養基，再加入含藥培養基，避免藥物被舊培養基稀釋。如果藥物溶解度低，注意DMSO終濃度不超過0.1%。

·       給藥后輕輕敲擊培養板側壁混勻，不要吹打（會損傷細胞）。放入培養箱時注意水平放置，避免培養板傾斜導致細胞分布不均。

2.3  第三步：CCK-8孵育前的形態學拍照（核心步驟！）

這是顯微鏡輔助CCK-8檢測最核心的一步。在加入CCK-8之前，用LF200對各孔細胞進行形態學拍照，記錄給藥后的細胞狀態。這些照片將成為你后續分析OD值的重要佐證。

LF200相差模式操作步驟：

1.       打開透射LED光源，亮度調到60%-70%（相差模式不需要太亮）。

2.       物鏡轉盤轉到10×相差物鏡（物鏡上標有「PH」或「Phase」字樣）。

3.       旋轉聚光鏡上的相差轉盤，將「10」標記對準定位點（會聽到「咔噠」一聲）。注意：相差環倍率必須與物鏡倍率一致，否則成像模糊。

圖5  相差轉盤對位——將與物鏡倍率一致的相差環（圖示為10×）旋入光路

4.       先用粗調手輪大致對焦，看到細胞輪廓后再用微調手輪精細調焦。LF200的微調精度達0.002 mm，輕輕轉動就能獲得清晰圖像。

5.       如果圖像對比度不夠，檢查相差環是否對位準確；如果圖像偏暗，適當調高光源亮度；如果細胞邊緣有光暈，檢查聚光鏡高度是否合適。

6.       每孔隨機選擇3個有代表性的視野拍照，保存為TIFF或高質量JPEG格式。文件名建議包含濃度、孔號、視野編號，如「10uM_B5_1.tif」。

圖6  相差模式下的細胞成像——無需染色，細胞輪廓、細胞核、細胞間連接清晰可見

拍照時的三個實用技巧：

·       技巧一：固定曝光參數。所有孔的拍照使用相同的光源亮度、曝光時間和增益，這樣不同孔之間的圖像才有可比性。LF200的LED光源亮度穩定，配合相機的手動曝光模式，可以輕松實現參數統一。

·       技巧二：避開孔邊緣。拍照時盡量選擇孔中央區域，因為邊緣區域細胞分布可能不均勻，且容易出現邊緣效應。

·       技巧三：拍一張明場做對照。除了相差圖像，建議再拍一張明場圖像作為對照。明場下細胞透明度高，但可以看到細胞碎片和氣泡等相差模式下不明顯的結構。

2.4  第四步：加入CCK-8與孵育

形態學拍照完成后，加入CCK-8試劑。注意以下操作要點：

·       CCK-8試劑對光敏感，操作時盡量避光（可以關掉超凈臺的日光燈，留一盞小燈即可）。

·       加樣量為培養基體積的1/10（如100 μL培養基加10 μL CCK-8）。加樣時將槍頭伸入液面下緩慢注入，避免產生氣泡。如果不小心產生了氣泡，用無菌槍頭戳破，否則氣泡會嚴重影響OD讀數。

·       加完CCK-8后，輕輕敲擊培養板側壁或在桌面上做十字形滑動，使CCK-8與培養基充分混勻。注意不要劇烈晃動，避免細胞脫落。

·       孵育時間需要根據細胞類型和密度預實驗確定。一般來說，細胞密度高、代謝旺盛的細胞孵育1-2 h即可；細胞密度低或代謝緩慢的細胞可能需要3-4 h。孵育時間過長會導致OD值過高（>2.5），進入非線性范圍，數據不可靠。

2.5  第五步：孵育后的二次鏡檢與酶標儀讀數

CCK-8孵育結束后，先別急著拿去讀板。用LF200再快速看一眼各孔，重點觀察：

·       培養基顏色是否變成橙黃色？顏色越深說明活細胞越多。如果某孔顏色異常淺，檢查是否細胞脫落或死亡。

·       有無氣泡？孵育過程中可能產生新的氣泡，讀數前務必清除。

·       細胞是否大量漂浮？如果給藥組細胞大量漂浮死亡，說明藥物毒性強，CCK-8的OD值可能偏低（漂浮細胞在洗板時丟失），此時形態學照片尤為重要。

鏡檢完成后，用酶標儀測定450 nm OD值（參考波長600-650 nm）。讀數時注意：

·       酶標儀讀數前，將培養板在桌面上靜置1-2 min，讓氣泡上浮、細胞沉降穩定。

·       如果酶標儀有振蕩功能，讀數前低速振蕩5-10 s，使孔內顏色均勻（注意不要振蕩太劇烈導致氣泡產生）。

·       每塊板讀兩次，取平均值。如果兩次讀數差異較大，檢查是否有氣泡或儀器故障。

第三部分  LF200關鍵操作技巧：讓你的圖像更專業

3.1  調焦技巧：如何快速獲得清晰圖像

很多新手在使用顯微鏡時，調焦就要花好幾分鐘，還經常找不到焦距。掌握以下技巧，10秒內就能獲得清晰圖像：

·       先低倍后高倍：永遠先用4×或10×低倍物鏡找到細胞并對焦，再轉高倍物鏡。低倍鏡視野大、景深大，容易找到目標。

·       利用載物臺限位：LF200的調焦手輪帶有限位裝置。在低倍鏡下對焦完成后，將限位旋鈕鎖緊，這樣轉高倍鏡時只需要微調即可，不會因為粗調過度而碰壞樣本。

·       微調為主：找到大致焦平面后，只用微調手輪精細調節。LF200微調精度0.002 mm，輕輕轉動就能看到圖像從模糊到清晰的全過程。

·       眼睛放松：觀察時雙眼同時睜開（雖然只用一只眼看目鏡），避免瞇眼導致疲勞。LF200的鉸鏈式雙目鏡筒可調節瞳距（53-75 mm），先調好瞳距再觀察，長時間使用也不累。

圖7  LF200低手位同軸調焦手輪——粗調微調同軸，扭矩可調，帶限位鎖緊裝置

3.2  相差成像優化：消除光暈，提升對比度

相差顯微鏡成像最常見的問題是光暈（halo）和對比度不足。以下方法可以有效改善相差圖像質量：

·       確保相差環與物鏡倍率匹配：這是最常見的錯誤。用10×物鏡時相差轉盤必須轉到「10」，用20×物鏡時轉到「20」，以此類推。倍率不匹配時圖像會出現嚴重光暈或對比度極低。

·       調節聚光鏡高度：聚光鏡的高度會影響相差效果。LF200的聚光鏡為可拆卸式，工作距離48-60 mm。觀察96孔板時，將聚光鏡升到最高位置（靠近培養板底部），可以獲得最佳對比度。

·       調節視場光闌：適當縮小視場光闌可以減少雜散光，提高圖像對比度。但不要縮得太小，否則視野邊緣會變暗。

·       使用綠色濾色片：LF200配備黃、綠、藍、磨砂四色濾色片。觀察相差圖像時，加入綠色濾色片可以提高分辨率和對比度（人眼對綠光最敏感，且綠色光的色差最小）。

圖8  LF200配備的黃、綠、藍三色濾色片——綠色濾色片可提升相差成像對比度

3.3  熒光成像技巧：獲得高信噪比的熒光圖像

如果需要進行AO-PI等熒光復染，LF200的電動LED熒光激發盒可以輕松實現多通道熒光成像。以下是獲得高質量熒光圖像的關鍵技巧：

·       通道選擇：AO（吖啶橙）用FITC通道觀察（綠色熒光），PI（碘化丙啶）用TRITC通道觀察（紅色熒光）。LF200電動切換通道，顯示屏實時顯示當前通道，一鍵切換無需手動拉桿。

·       曝光時間：熒光成像的曝光時間需要根據熒光強度調整。一般來說，AO綠色熒光較強，曝光50-200 ms即可；PI紅色熒光稍弱，可能需要200-500 ms。曝光時間過長會導致背景噪聲增大，過短則信號不足。建議從短曝光開始試，逐步增加。

·       光漂白防護：熒光染料在激發光照射下會發生光漂白，信號逐漸減弱。操作時盡量縮短激發光照射時間，不拍照時關閉熒光光源（LF200電動熒光盒有自動開關功能，不操作時自動關閉光源，有效減少光漂白）。

·       多通道疊加：分別采集FITC和TRITC通道圖像后，用ImageJ或成像軟件進行多通道疊加。疊加時注意各通道的圖像尺寸和像素位置要一致（LF200的電動通道切換重復性好，各通道圖像基本無需對齊）。

圖9  多通道熒光疊加圖像——綠色（AO）標記活細胞，紅色（PI）標記死細胞，疊加后可直觀判斷活死比例

3.4  相機與圖像采集：拍出可用的好照片

LF200配備0.5×/1× C-MOUNT國際標準接口，可搭配230-2500萬像素高畫質顯微相機或高速相機。相機安裝在左下傾C-Mount接口上，不干擾目視觀察，且100%通光率特別適合弱熒光成像。

圖像采集注意事項：

·       分辨率設置：常規記錄用1920×1080即可；需要發表或精細分析時，建議用相機最高分辨率（如5320×4600）。

·       圖像格式：日常記錄用JPEG即可（質量設為90%以上）；需要后續定量分析時，保存為TIFF無損格式。

·       標尺疊加：成像軟件一般支持疊加比例尺。拍照時記得打開比例尺功能，這樣后續在論文或報告中使用時無需額外標注。

·       文件命名：養成良好的文件命名習慣，建議格式為「日期_細胞系_藥物濃度_孔號_倍率_通道_序號」，如「20240601_HepG2_10uM_B5_10x_Phase_01.tif」。

圖10  LF200左下傾C-Mount接口安裝的LIT Firefly 21顯微相機——不擋目鏡，100%通光率

第四部分  常見問題排查：遇到問題不要慌

4.1  CCK-8相關問題

4.2  顯微鏡成像相關問題

·       問題：相差圖像模糊、對比度差。原因：相差環與物鏡倍率不匹配；聚光鏡高度不對；物鏡鏡頭臟。解決：核對相差環倍率；調節聚光鏡高度；清潔物鏡鏡頭。

·       問題：熒光圖像背景噪聲大。原因：曝光時間過長；增益設置過高；熒光染料濃度過高；有非特異性染色。解決：縮短曝光時間；降低增益；優化染料濃度；增加洗滌次數。

·       問題：熒光信號很快消失（光漂白）。原因：激發光照射時間過長；熒光染料抗淬滅性差。解決：縮短照射時間（不拍照時關閉光源）；使用抗淬滅封片劑；降低激發光強度。

·       問題：圖像中有黑點或污點。原因：目鏡或物鏡鏡頭臟；相機傳感器有灰塵；培養板底部有雜質。解決：用擦鏡紙清潔光學部件；用吹氣球清潔相機傳感器；更換清潔的培養板。

·       問題：高倍鏡下找不到細胞。原因：低倍鏡下沒有把目標移到視野中央；高倍鏡工作距離短，對焦范圍小。解決：低倍鏡下將目標移到視野正中央再轉高倍鏡；高倍鏡下只用微調手輪緩慢對焦。

第五部分  圖像分析與數據呈現：讓結果更有說服力

5.1  形態學圖像的定性分析

顯微鏡拍攝的形態學圖像不僅是「好看的配圖」，更是你解釋CCK-8數據的重要證據。在論文或報告中，建議按以下方式呈現形態學結果：

·       濃度梯度系列圖：選取對照組和幾個代表性濃度組的相差圖像，按濃度從低到高排列，直觀展示細胞形態隨藥物濃度的變化趨勢。每張圖標注濃度和倍率。

·       關鍵形態特征標注：在圖像上用箭頭或圓圈標注關鍵形態特征，如「↑凋亡小體」「↑細胞皺縮」「↑細胞碎片」「↑漂浮細胞」等，讓讀者一眼就能看到你想表達的信息。

·       明場+相差+熒光三聯圖：如果做了AO-PI熒光復染，可以將明場、相差、熒光疊加三張圖并排展示，全面呈現細胞狀態。

5.2  細胞計數與活死比例分析

如果需要對熒光圖像進行定量分析（如活死細胞比例），可以使用ImageJ（免費開源）進行細胞計數。基本流程如下：

7.       打開熒光圖像（FITC通道=活細胞，TRITC通道=死細胞）。

8.       Image → Adjust → Threshold，調整閾值將細胞核與背景分開。

9.       Analyze → Analyze Particles，設置合適的顆粒大小范圍（排除碎片和聚集體），勾選「Display results」和「Summarize」。

10.       記錄活細胞數和死細胞數，計算活細胞比例=活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。

11.       每個樣本統計至少5個視野，取平均值。

注意：細胞計數時要排除細胞碎片（體積明顯小于正常細胞核）和重疊細胞（兩個細胞核粘在一起可能被計為一個）。如果細胞重疊嚴重，建議降低接種密度或使用專業的圖像分析軟件（如CellProfiler、Imaris）。

5.3  數據呈現的最佳實踐

·       CCK-8數據用柱狀圖或折線圖呈現，Y軸為細胞存活率（%），X軸為藥物濃度（對數刻度）。誤差棒表示標準差（SD）或標準誤（SEM），并在圖注中說明。

·       在劑量-反應曲線中標注IC??值和95%置信區間。

·       形態學圖像作為圖版（Figure）的一部分，與定量數據相互印證。例如，圖A為劑量-反應曲線，圖B為各濃度組的代表性相差圖像。

·       在結果文字描述中，將OD值與形態學觀察結合起來描述，如「10 μmol/L順鉑組細胞存活率為65.4%，相差顯微鏡下可見約30%細胞出現皺縮和凋亡形態，提示該濃度下細胞以早期凋亡為主」。這樣的描述比單純報數字更有說服力。

第六部分  高級應用拓展：不止于CCK-8

6.1  活細胞動態成像

LF200配備的電動LED熒光激發盒支持軟件控制，配合高速相機（最高1000000幀/秒）和活細胞培養艙，可以實現藥物作用過程中細胞形態和熒光信號的動態監測。例如，可以連續拍攝藥物加入后0、1、2、4、8、12、24 h的細胞圖像，制作成延時視頻（time-lapse），直觀展示細胞凋亡的動態過程。這比終點法的CCK-8檢測能提供更豐富的動力學信息。

6.2  3D細胞培養與類器官觀察

隨著3D細胞培養技術的發展，越來越多的實驗室開始使用細胞球（spheroid）和類器官（organoid）進行藥物篩選。LF200的超長工作距離聚光系統（擺出后172 mm）和長工作距離物鏡，非常適合觀察3D培養體系。配合Z軸層掃（Z-stack）功能，可以對細胞球進行多層掃描，重建3D結構，評估藥物對細胞球內部細胞的殺傷效果。

圖11  LF200長工作距離聚光鏡（擺入狀態48-60 mm）——兼容各種培養容器，3D培養也能輕松觀察

6.3  多色熒光標記與共定位分析

LF200電動熒光激發盒最高支持5通道，標配DAPI、FITC、TRITC三色熒光組，還可根據需求選配其他熒光通道。這意味著你可以同時進行多色熒光標記，例如：DAPI標記細胞核、FITC標記目標蛋白、TRITC標記細胞骨架，然后通過共定位分析研究蛋白的亞細胞定位。在CCK-8檢測的基礎上增加免疫熒光染色，可以從細胞活力、蛋白表達、形態變化多個維度全面評估藥物作用。

6.4  與其他檢測方法的聯合使用

CCK-8只是細胞活力檢測的方法之一。結合LF200顯微鏡，你還可以開展以下檢測：

·       EdU增殖檢測：用FITC通道觀察EdU陽性細胞（增殖中的細胞），比CCK-8更直接地反映細胞增殖情況。

·       Annexin V/PI凋亡檢測：用FITC通道觀察Annexin V（早期凋亡），TRITC通道觀察PI（晚期凋亡/壞死），準確區分凋亡階段。

·       JC-1線粒體膜電位檢測：用FITC和TRITC雙通道觀察JC-1單體/聚合物比例，評估線粒體功能（CCK-8的原理就是線粒體脫氫酶活性，JC-1可以提供更直接的線粒體功能證據）。

·       細胞劃痕實驗：用LF200明場模式拍攝劃痕愈合過程，評估細胞遷移能力，與CCK-8的增殖數據互補。

寫在最后：讓顯微鏡成為你的實驗「第三只眼」

CCK-8實驗的可靠性，不僅取決于加樣的精準和孵育的規范，更取決于你對細胞狀態的實時掌控。一臺好用的倒置熒光顯微鏡，就像是你的「第三只眼」，讓你在實驗的每一個環節都能看到細胞的真實狀態，避免被OD值這個「黑箱數字」誤導。

國產萊特LF200倒置熒光顯微鏡以其穩定的光學性能、便捷的操作設計和高性價比，成為細胞生物學實驗室的理想選擇。無論是日常的明場/相差觀察，還是多通道熒光成像，LF200都能輕松勝任。希望本文的實操技巧和問題排查方案能幫助你更好地使用LF200，讓你的CCK-8實驗數據更可靠、更有說服力。

記住：好的實驗數據，是「看」出來的，不只是「讀」出來的。