LF50倒置熒光顯微鏡在活/死細胞
雙色熒光染色（AO/PI 法）檢測中的應用解決方案

基于緊湊型 LED 熒光激發與直立三目數碼觀察的規范化細胞活性評估指南

圖 1：萊特 LF50 倒置熒光顯微鏡整機結構與數碼成像系統

一、 應用背景與 AO/PI 雙色熒光檢測原理

在細胞毒理學、原代細胞分離提取、免疫學評估及細胞工程研究中，精準測定細胞懸液或培養物中的活細胞與死細胞比例是核心環節。吖啶橙（Acridine Orange, AO）與碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）聯合使用的 AO/PI 雙色熒光染色法，能夠特異性鑒定細胞質膜的完整性。相比于傳統臺盼藍（Trypan Blue）明場染色，AO/PI 染色法能有效排除原代樣品中的無核碎片、紅細胞及雜質干擾，大幅提升計算結果的準確性。

1.1 AO 與 PI 熒光探針的作用機制

二、 LF50倒置熒光顯微鏡核心硬件與技術支撐

萊特 LF50 倒置熒光顯微鏡采用無限遠獨立校正光學系統與高穩定性結構設計，為 AO/PI 熒光活死細胞檢測提供了契合的技術硬件支撐：

2.1 緊湊光源/激發一體化 LED 熒光系統（手動/電動可選）

LF50 采用了光源與激發塊一體化的緊湊型 LED 熒光激發盒，內置大功率高亮 LED 光源，支持無級調光，可實現即開即用（無傳統汞燈預熱與冷卻等待的困擾）。系統最多支持 5 通道擴展，標配包含 FITC（GFP）、TRITC（CY3）及 DAPI 三色濾光組，能夠準確匹配 AO（綠色）與 PI（紅色）的激發和發射波長。電動款激發盒還配有液晶顯示屏，支持光強記憶與軟件控制。

圖 2：LF50 緊湊光源/激發一體化 LED 熒光激發盒（帶無級調光與通道顯示）

圖 3：LF50 匹配的高透光率 FITC / TRITC / DAPI 熒光濾光塊

2.2 72mm 超長工作距離聚光鏡與護目板設計

LF50 配備 72mm 超長工作距離聚光鏡（數值孔徑 N.A. 0.30），帶可調光欄與非球面鏡片，提供均勻一致的相襯照明。當拆卸聚光鏡后，縱向工作空間可拓展至 160mm，方便直接承載大型培養皿或細胞工廠。此外，LF50 配有快拆裝護目板，能有效濾除強激發光的反射，保護實驗人員的眼睛。

圖 4：LF50 護目板與 72mm 超長工作距離聚光系統

2.3 30° 傾斜三目觀察筒與 0.001mm 高精度低手位調焦

LF50 配備 30° 傾斜鉸鏈式三目觀察筒，支持 360° 旋轉與大范圍瞳距調節（48–75mm），配合 WF10X/22mm 平場大視野目鏡，提供舒適的觀視體驗。調焦機構采用左右同軸低手位手輪，微調精度高達 0.001mm（行程 15mm），帶限位與鎖緊裝置，可實現快速精準對焦。

圖 5：LF50 30° 傾斜三目筒與低手位同軸調焦機構

2.4 直立頂置三碼接口與高畫質顯微相機

LF50 采用直立頂置三目 C-MOUNT 成像接口（分光比 0:100 / 100:0），支持掛載 230–2500 萬像素高靈敏度數碼顯微相機。結合專用配套軟件，可實現電腦端實時預覽、低照度熒光圖像采集及自動化圖像疊加分析。

圖 6：LF50 頂置三目接口連接高畫質數碼顯微相機

三、 AO/PI 雙色熒光檢測標準解決方案流程

為了在 LF50 顯微鏡下獲得低背景噪聲、對比度清晰的雙色熒光圖像及準確的細胞活性數據，推薦采用以下標準化操作流程：

步驟 1：試劑配制與樣品準備

• 工作液配制：使用無熒光背景的 PBS 緩沖液將 AO 與 PI 儲存液稀釋為雙染色工作液（建議終濃度：AO 約 5–10 μg/mL，PI 約 10–20 μg/mL），避光保存，現配現用。

• 細胞洗滌：取待測貼壁細胞、懸浮細胞或原代懸液，用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養基成分及殘余血清干擾。

步驟 2：樣品混合染色與孵育

• 混合染色：將 AO/PI 混合工作液與細胞懸液按 1:1 比例充分混合（或直接加入培養板孔中），確保染色液均勻覆蓋細胞。

• 避光溫育：室溫避光孵育 5–10 分鐘。由于 AO/PI 與核酸結合迅速，建議在 20 分鐘內完成上樣與采集。

步驟 3：LF50 快速上樣與相襯聚焦

• 樣品放置：將染色后的血球計數板、載玻片或培養皿置于 LF50 載物臺上，使用加粗固定夾固定。

• 明場/相襯定位：開啟 LED 明場光源，推動相差板切入對應相襯環（如 10X 或 20X），利用 0.001mm 高精度微調手輪快速找到代表性視野焦面。

步驟 4：多通道熒光圖像采集

• FITC 通道采集（活細胞）：將熒光激發盒切換至 FITC 綠光通道，開啟 LED 熒光激發，采集綠色胞質/胞核熒光圖像（綠光細胞為活細胞）。

• TRITC 通道采集（死細胞）：切換至 TRITC 紅光通道，系統還原預設光強，采集紅色胞核熒光圖像（紅光細胞為死細胞/膜受損細胞）。

步驟 5：圖像合成與細胞存活率分析

• 圖像傳輸與疊加：通過頂置三目接口掛載的顯微相機傳輸數據，利用配套軟件對 FITC 與 TRITC 圖像進行 Overlay/Merge 通道疊加。

• 活性定量計算：分別統計全視野內的綠光活細胞數（Live）與紅光死細胞數（Dead），計算細胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型圖像結果與數據評估

在 LF50 高質光學系統與高信噪比 LED 熒光光路支持下，AO/PI 染色呈現出界限分明的形態與光譜特征：

圖 7：LF50 下采集的高信噪比多通道細胞熒光圖譜（亮視野與低背景噪點）

五、 規范操作注意事項與設備保養建議

5.1 染色時間控制：染色混合后建議在 20 分鐘內完成熒光觀察與圖像采集。孵育時間過長可能導致 AO 濃度變化或 PI 被活細胞內吞造成假陽性。

5.2 激發光功率調節：利用 LF50 熒光激發盒的無級調光與光強記憶功能，在拍攝強度滿足的前提下適當調低 LED 激發功率，以減緩熒光漂白。

5.3 護目板規范使用：在強激發光觀察時請拉出護目板，保護實驗人員視力健康。

5.4 鏡片維護保養：半復平場消色差物鏡透鏡表面需定期檢查，若沾有灰塵或培養基，應用氣吹或專用的無塵紙沾取無水乙醇輕輕擦拭，保持優良的透光性能。